Use of scanning electron microscopy in the cochlea of guinea pigs / Microscopia eletrônica de varredura em cócleas de cobaias

Abstract Introduction: The use of electron microscopy in the study of the inner ear has allowed us to observe minute details of the hair cells, especially in ototoxicity studies; however, the preparation of this material is a difficult and delicate task. In an attempt to simplify the handling of these materials, two agents, toluidine blue and ethylenediamine tetra-acetic acid were tested, in addition to the elimination of osmium tetroxide during the preparation of albino guinea pig cochleae. We also tested the applicability of these methodologies in an ototoxicity protocol. Objective: To verify the quality of the images obtained with and without the use of ethylenediamine tetra-acetic acid, toluidine blue and osmium tetroxide in the preparation of cochleae of albino guinea pigs for the scanning electron microscopy. Methods: Three groups of cochleae were used. In Group 1, 10 cochleae were prepared with the usual methodology, dissecting the optical capsule without decalcification and using osmium tetroxide as a post-fixative agent. In Group 2, we prepared 10 cochleae decalcified with ethylenediamine tetra-acetic acid, injecting toluidine blue in the endolymphatic space to facilitate the identification of the organ of Corti. In Group 3, we used 4 cochleae of guinea pigs that received 3 doses of cisplatin (7.5 mg/kg, D1-D5-D6), two prepared according to the methodology used in Group 1 and two with that used in Group 2. Scanning electron microscopy images were obtained from the organ of Corti region of the basal turn of each cochlea. Results: The organ of Corti was more easily identified with the use of toluidine blue. The dissection of the cochlea was more accurate in the decalcified cochleae. The quality of the images and the preservation of the organ of Corti obtained with the two methodologies were similar. Conclusion: The proposed modifications resulted in images of similar quality as those observed using the traditional methodology.

Resumo Introdução: O emprego da microscopia eletrônica no estudo da orelha interna permitiu observar detalhes minuciosos das células ciliadas especialmente em estudos de ototoxicidade. Entretanto, o preparo desse material é trabalhoso e delicado. Para simplificar a manipulação desses materiais, testou-se o uso de dois agentes, azul de toluidina e ácido etilenodiamino tetra-acético, além da retirada do tetróxido de ósmio na preparação de cócleas de cobaias albinas. Testamos também a aplicabilidade dessas metodologias em um protocolo de ototoxicidade. Objetivo: Verificar a qualidade das imagens obtidas com e sem o uso de ácido etilenodiamino tetra-acético, azul de toluidina e tetróxido de ósmio na preparação de cócleas de cobaias albinas para a microscopia eletrônica de varredura. Método: Foram utilizados três grupos de cócleas. No Grupo 1 preparou-se 10 cócleas com a metodologia usual, dissecando a cápsula ótica sem descalcificac¸ão e utilizando tetróxido de ósmio como pós-fixador. No Grupo 2 preparamos 10 cócleas descalcificadas com ácido etilenodiamino tetra-acético, injetando azul de toluidina no espac¸o endolinfático para facilitar a identificação do órgão de Corti. No Grupo 3 utilizamos 4 cócleas de cobaias que receberam 3 doses de cisplatina (7,5 mg/kg, D1-D5-D6), duas preparadas com a metodologia do Grupo 1 e duas com a do Grupo 2. Foram obtidas imagens da microscopia eletrônica de varredura da região do órgão de Corti do giro basal de cada cóclea. Resultados: O órgão de Corti foi mais facilmente identificado com o azul de touidina. A dissecção da cóclea foi mais precisa nas cócleas descalcificadas A qualidade das imagens e a preservac¸ão do órgão de Corti obtidas com as duas metodologias foi similar. Conclusão: As modificações propostas resultaram em imagens de qualidade similar as observadas com o uso da metodologia tradicional.

Lack of protection against gentamicin ototoxicity by auditory conditioning with noise / Falta de proteção contra a ototoxicidade da gentamicina pelo condicionamento auditivo com ruído

INTRODUCTION: Auditory conditioning consists of the pre-exposure to low levels of a potential harmful agent to protect against a subsequent harmful presentation. OBJECTIVE: To confirm if conditioning with an agent different from the used to cause the trauma can also be effective. METHOD: Experimental study with 17 guinea pigs divided as follows: group Som: exposed to 85 dB broadband noise centered at 4 kHz, 30 minutes a day for 10 consecutive days; group Cont: intramuscular administration of gentamicin 160 mg/kg a day for 10 consecutive days; group Expt: conditioned with noise similarly to group Som and, after each noise presentation, received gentamicin similarly to group Cont. The animals were evaluated by distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs), brainstem auditory evoked potentials (BAEPs) and scanning electron microscopy. RESULTS: The animals that were conditioned with noise did not show any protective effect compared to the ones that received only the ototoxic gentamicin administration. This lack of protection was observed functionally and morphologically. CONCLUSION: Conditioning with 85 dB broadband noise, 30 min a day for 10 consecutive days does not protect against an ototoxic gentamicin administration of 160 mg/kg a day for 10 consecutive days in the guinea pig. .

INTRODUÇÃO: O condicionamento auditivo consiste da pré-exposição de um agente lesivo em baixos níveis para proteger contra uma posterior apresentação lesiva. OBJETIVO: Confirmar se o condicionamento com um agente diferente do utilizado para causar o trauma pode ser efetivo. MÉTODO: Estudo experimental com 17 cobaias albinas divididas como a seguir- grupo Som: exposto a um ruído branco de 85 dB centrado em 4 kHz, 30 minutos por dia, por 10 dias consecutivos; grupo Cont: administração intramuscular de gentamicina 160 mg/kg por dia, por 10 dias consecutivos; grupo Expt: condicionado com ruído como o grupo Som. Após cada exposição ao ruído, recebeu gentamicina similarmente ao grupo Cont. Os animais foram avaliados por emissões otoacústicas produto de distorção (EOAPDs), potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). RESULTADOS: Os animais que foram condicionados com ruído não mostraram qualquer efeito protetor quando comparados com os que receberam apenas a gentamicina em doses ototóxicas. Esta ausência de proteção foi observada tanto funcionalmente quanto morfologicamente. CONCLUSÃO: Os autores concluíram que o condicionamento com ruído branco a 85 dB por 30 minutos, por dia por 10 dias consecutivos, não protege contra uma administração de gentamicina 160 mg/kg/dia, por 10 dias consecutivos. .

Otoproteção em cobaias expostas a agrotóxico e ginkgo biloba / Otoprotection in guinea pigs exposed to pesticides and ginkgo biloba

Os agrotóxicos são amplamente utilizados na agricultura e, atualmente, fazem parte do grupo de agentes químicos que podem levar à perda auditiva. A identificação de drogas que, associadas aos ototóxicos, possam atuar como otoprotetores é objeto de estudo. OBJETIVO: Analisar a existência de efeito otoprotetor do extrato de Ginkgo biloba aos possíveis danos cocleares causados pelo agrotóxico do grupo dos organofosforados - metamidofós, avaliando-se as alterações anatômicas por meio da microscopia eletrônica de superfície. MATERIAL E MÉTODO: Estudo experimental prospectivo utilizando 21 cobaias, que sofreram ação da administração de soro fisiológico, agrotóxico e ginkgo biloba isoladamente e associadas, durante sete dias consecutivos. Após, as cócleas foram removidas e avaliadas anatomicamente pela microscopia eletrônica de varredura. RESULTADOS: As cobaias submetidas ao agrotóxico apresentaram alterações morfológicas cocleares, com lesões nas três espiras analisadas na microscopia eletrônica, intensificadas de acordo com a dosagem recebida do agente. As cobaias tratadas com agrotóxico e Ginkgo biloba apresentaram uma manutenção da arquitetura ciliar nas células ciliadas externas em todas as espiras da cóclea. CONCLUSÃO: O extrato de Ginkgo biloba, por sua ação antioxidante, atuou como fator otoprotetor à ototoxicidade pelo agrotóxico em cobaias.

Pesticides are widely used in agriculture, despite the risk of hearing loss related to the exposure to their chemical components. This study looks into protective drugs to counteract the ototoxicity of pesticides. OBJECTIVE: This study aims to analyze the effect ginkgo biloba extract may have in protecting against possible cochlear damage caused by organophosphate pesticides (methamidophos). Anatomic changes are assessed through surface and electron microscopy. MATERIALS AND METHODS: This is a prospective experimental study. Twenty-one guinea pigs were given saline solution, pesticide, and ginkgo biloba alone or combined for seven consecutive days. Then their cochleas were removed and examined in a scanning electron microscope. RESULTS: Pesticide-exposed guinea pigs had morphological alterations in their cochleas and injuries in the three turns analyzed through electron microscopy. Injury intensity varied according to the dosages of the agents given to the test subjects. Guinea pigs treated with pesticide and ginkgo biloba maintained the architecture of their outer hair cells in all cochlear turns. CONCLUSION: The antioxidant properties found in the ginkgo biloba extract protected guinea pigs from pesticide ototoxicity.

Ototoxicidade por organofosforados: descrição dos aspectos ultraestruturais do sistema vestibulococlear de cobaias / Organophosphate-related ototoxicity: Description of the vestibulocochlear system ultrastructural aspects of guinea pigs

Os agrotóxicos organofosforados são amplamente utilizados na agricultura, e atualmente fazem parte do grupo de agentes químicos que podem levar à perda auditiva, no qual já estavam incluídos os solventes, os metais e os asfixiantes. OBJETIVO: Analisar a ação ototóxica aguda de um agrotóxico do grupo dos organofosforados na citoarquitetura do sistema vestibulococlear. Trata-se de um estudo experimental prospectivo. MATERIAL E MÉTODO: Foram utilizadas cobaias albinas machos, divididas em três grupos, nos quais se administrou água destilada (grupo 1 - controle), agrotóxico - 0,3mg/Kg/dia (grupo 2), agrotóxico - 3 mg/Kg/dia (grupo 3), durante sete dias consecutivos. O agrotóxico utilizado foi Tamaron BR (metamidofós). A avaliação anatômica da cóclea, sáculo e utrículo foi realizada através da microscopia eletrônica de varredura, após o período de aplicação do agrotóxico. RESULTADOS: As cobaias submetidas ao organofosforado apresentaram alterações morfológicas cocleares, com lesões nas três espiras analisadas, bem como alterações ciliares de sáculo e utrículo, intensificadas de acordo com a dosagem recebida do agente. CONCLUSÃO: As alterações morfológicas observadas nas células ciliadas nos grupos expostos a doses diárias de organofosforado promovem evidências de um efeito agudo degradante dos agrotóxicos no sistema vestibulococlear.

Organophosphate toxic agents are used in agriculture and are currently part of the group of toxic agents which can lead to hearing loss, in which we have solvents, metals and asphyxiation agents. AIM: to analyze the acute ototoxic action of a group of organophosphate agents in the vestibulo-cochlear system. This is a prospective experimental study. MATERIALS AND METHODS: we used male albino guinea pigs, broken down into three groups, to which we provided distilled water (group 1 - control), agrotoxic agent - 0.3mg/Kg/day (group 2), agrotoxic - 3 mg/Kg/day (group 3), during 7 seven consecutive days. The most used agrotoxic agent was Tamaron BR (metamidophos). The anatomical evaluation of the cochlea, saccule and utricle was carried out by means of electronic scanning microscopy after the use of the agrotoxic agent. RESULTS: the guinea pigs submitted to the organophosphate presented cochlear morphological alterations with lesions on the three turns analyzed, as well as cilia alterations in the saccule and utricle, intensified according to the agent dosage. CONCLUSION: the morphological alterations seen in the hair cells exposed to daily doses of organophosphate promote evidences of an acute deleterious effect of agrotoxic agents on the vestibulo-cochlear system.

O uso de Maytenus ilicifolia na prevenção da ototoxicidade induzida pela cisplatina / The use of Maytenus ilicifolia to prevent cisplatin-induced ototoxicity

Maytenus ilicifolia é uma planta sul americana apresenta várias propriedades medicinais, entre elas, a ação antioxidante. OBJETIVO: Por meio de um modelo original de ototoxicidade induzida pela cisplatina, verificar uma possível ação otoprotetora do extrato aquoso desta planta. MATERIAL E MÉTODO: Estudo clínico e experimental com cobaias fêmeas, albinas divididas em 5 grupos: 9 animais recebendo somente 3 doses de 7,5mg/kg/d do protocolo de cisplatina, 4 animais somente com o extrato, 10 animais com cisplatina e 1g/kg/d de extrato por 8 dias, 5 animais com cisplatina e 3g/kg/d do extrato por 8 dias e 5 animais recebendo extrato por 3 semanas e cisplatina na última semana. Os exames foram emissões otoacústica por produtos de distorção, potencial de tronco encefálico pré e após administração de cisplatina e, microscopia eletrônica de varredura. RESULTADOS: Os animais que receberam a cisplatina com o extrato, independente da dose, obtiveram alterações em todos os testes, com lesões na região basal na microscopia eletrônica. CONCLUSÃO: Apesar do efeito antioxidante da Maytenus ilicifolia, ela não foi suficiente para bloquear o efeito ototóxico da cisplatina.

Maytenus ilicifolia is a native plant from South America, with several medicinal properties including antioxidant effects. AIM: using an original cisplatin induced ototoxicity model, we evaluated a possible otoprotection caused by Maytenus ilicifolia extract. MATERIALS AND METHODS: clinical and experimental study design with female albino guinea pigs divided in groups as follows: 9 animals receiving cisplatin only (three doses of 7.5mg/kg/day), 4 animals receiving the plant extract only, 10 animals receiving the cisplatin protocol and 1g/kg/day of extract for 8 days, 5 animals with cisplatin and 3g/kg/day of extract for 8 days, and 5 animals receiving extract for 3 weeks and cisplatin in the last week. The tests were distortion product otoacoustic emissions, brainstem auditory response, before and after medication and scanning electron microscopy. RESULTS: the animals receiving cisplatin plus plant extract, had alterations in all the tests, showing lesions on the basal cochlear region under electron microscopy. CONCLUSIONS: Despite of the plant extract's antioxidant effect, it was not sufficient to protect the cochlea against cisplatin ototoxicity.

Anatomia microscópica do canal carótico e suas relações com a cóclea e a cavidade timpânica / Microscopic anatomy of the carotid canal and its relations with cochlea and middle ear

As relações entre as diversas estruturas nobres e vitais que se apresentam na intimidade do osso temporal constituem ainda hoje um grande desafio para o cirurgião otológico. Os estudos micro-anatômicos do mesmo se encontram entre as grandes armas na busca deste entendimento. OBJETIVO: Estudar as correlações anatômicas entre o canal carótico e a cóclea, e a ocorrência de deiscências do mesmo junto à cavidade timpânica. MATERIAL E MÉTODO: Estudo microscópico de 122 ossos temporais humanos. RESULTADOS As distâncias médias entre o canal carótico e os giros cocleares foram: no local de menor distância 1,05mm; no giro basal, 2,04mm; no giro médio, 2,32mm; e no giro apical, 5,7mm. A ocorrência de deiscências do canal carótico na cavidade timpânica foi de 35,2 por cento. CONCLUSÃO: A pequena distância entre estruturas cocleares e o canal carótico, e a alta prevalência de deiscências do mesmo na cavidade timpânica nos relembram o desafio com o qual o cirurgião otológico se depara ao atuar sobre o osso temporal.

Otoproteção da amifostina aos efeitos ototóxicos da cisplatina: estudo em cobaias albinas por emissões otoacústicas produtos de distorção e microscopia eletrônica de varredura

A Cisplatina é uma potente droga antineoplásica, largamente utilizada para o tratamento do câncer, tanto em adultos quanto em crianças. Dentre seus efeitos colaterais, a ototoxicidade se apresenta como um dos mais importantes e leva à perda auditiva irreversível, bilateral, para as altas freqüências (4KHz -8KHz). Estudos têm tentado identificar drogas que, associadas à cisplatina, possam atuar como otoprotetores. Sabe-se que o mecanismo da ototoxicidade pela cisplatina está relacionado a alterações nos mecanismos antioxidantes das células ciliadas, principalmente as células ciliadas externas da cóclea. A amifostina tem conhecida ação antioxidante, com conhecido efeito otoprotetor aos efeitos lesivos da radioterapia. OBJETIVO: Nossa proposta foi avaliar através de emissões otoacústicas, por produtos de distorção (EOAPD) e por microscopia eletrônica de varredura (MEV), a existência de possível efeito otoprotetor da amifostina no tratamento com cisplatina. FORMA DE ESTUDO: Experimental. MATERIAL E MÉTODO: O estudo foi realizado em cobaias albinas, que foram divididas em três grupos: Grupo 1: 6 animais -12 orelhas - cisplatina 8,0 mg/Kg/dia (via intraperitoneal) por três dias; Grupo 2: 6 animais - 12 orelhas - amifostina 100 mg/Kg/ dia (via intraperitoneal) e 90 minutos após, cisplatina 8,0 mg/Kg/dia (via intraperitoneal) por três dias; Grupo 3: 03 animais - 06 orelhas - amifostina 100 mg/Kg/dia (via intraperitoneal) por três dias. RESULTADO: Encontramos EOAPD presentes e células ciliadas externas presentes, sem lesão anatômica a MEV, nos grupos 2 e 3. Concluímos que a amifostina, por sua ação antioxidante, atua como otoprotetor a ototoxicidade pela cisplatina. No entanto, seu uso não é recomendável nos casos de tumores potencialmente curáveis, por não se saber exatamente a influência da cisplatina na eficácia da quimioterapia.

protective effects of vitamin E versus vitamin C against cisplatin ototoxicity in guinea pigs [histological and audiological study]

The protective effects of both vitamin E and C against cisplatin induced ototoxicity were assessed histologically and audiogically. This was done by quantifying the extent of cochlear damage with the light microscope, scanning electron microscope and with measurement of the Distortion Product Otoacoustic Emissions [DPOAEs]. Twenty-five adult male guinea pigs were used in this study. They were divided into control group, cisplatin group that was injected 8 mg/kg cisplatin intra-peritoneally [i.p.], vitamin E group that was injected 500 mg/kg of vitamin E i.p.30 mm prior to cisplatin injection, and vitamin C group which was given 200 mg/kg of vitamin C i.p. 30 min before cisplatin administration. When administered alone, cisplatin induced loss and vacuolation of outer hair cells [OHCs] as seen by LM examination. Scanning EM revealed fusion, disarrangement and loss of some stereocilia in the remaining OHCs especially in the basal turn. In contrast, inner hair cells resisted cisplatin ototoxicity. Audiological assessment demonstrated reduction in DPOAEs amplitudes and S/N values in all frequencies. Both vitamin E and C reduced cisplatin ototoxicity, with better protection achieved by vitamin C administration. Scanning EM examination showed that OHCs were similar to the control configuration after vitamin C administration while after protection with vitamin E, OHCs of the third row showed fusion and absorption of the stereocilia in some parts. In addition, both DPOAEs amplitudes and S/N ratio were near the control values up to 4 KHz. However, above 4 KHz both vitamins failed to achieve the full protection, with vitamin C showing better performance in these high frequencies. We conclude that both vitamins had protective effects against cisplatin induced ototoxicity, with vitamin C inducing more protection in the used regimen